Dina prosés ngalaksanakeun studi genetik, urang mindeng sapatemon sampel RNA teu cukup, contona, pikeun nalungtik tumor lisan anatomis leutik, sanajan sampel sél tunggal, sarta sampel mutasi gen husus nu ditranskripsi dina tingkat pisan low dina sél manusa.Tangtosna, pikeun tés COVID-19, upami swabs henteu aya dina tempat anu leres atanapi henteu cekap waktos nalika sampling, ukuran sampelna bakal rendah pisan, naha éta Komisi Kaséhatan sareng Keluarga Berencana kaluar dua dinten ka pengker sareng lulus tés, sarta lamun sampler asam nukléat teu nyandak genep sampel, Anjeun bisa ngalaporkeun eta.
Sensitipitas réagen penting sabab urang ngagaduhan masalah ieu atanapi masalah éta, janten naon anu urang tiasa laksanakeun pikeun ningkatkeun sensitipitas RT-PCR?
Sateuacan urang ngabahas solusi anu mungkin, hayu urang nyebatkeun dua komplikasi anu ageung sareng kaayaan anu nembé disebatkeun.
Anu mimiti, urang hariwang ngeunaan leungitna RNA nalika urang ngan ukur gaduh sababaraha populasi sél dina sampel urang.Upami metode pamisahan sareng beberesih tradisional dianggo, sapertos metode kolom atanapi metode présipitasi asam nukléat, aya kamungkinan luhur yén sababaraha conto bakal leungit.Hiji leyuran nyaéta pikeun nambahkeun molekul pamawa, kayaning tRNA, tapi sanajan kitu, euweuh jaminan yén percobaan recovery urang OK.
Janten naon cara anu langkung saé?Pilihan anu hadé pikeun sél kultur atanapi sampel mikroanatomi nyaéta ngagunakeun lisis langsung.
Idena nyaéta pikeun ngabagi sél salami 5 menit, ngaleupaskeun RNA kana solusi, teras ngeureunkeun réaksina salami 2 menit, teras tambahkeun lisat langsung kana réaksi transkripsi sabalikna supados henteu aya RNA anu leungit, sareng tungtungna nempatkeun cDNA anu hasilna langsung. kana réaksi real-time.
Tapi kumaha upami, kusabab titik awal kawates atanapi sajumlah leutik éksprési gén target, urang tiasa ngadaur ulang sadayana RNA sareng masih henteu nyayogikeun template anu cukup pikeun kéngingkeun sinyal waktos nyata anu saé?
Dina hal ieu, lengkah pre-amplifikasi tiasa pisan mangpaat.
Di handap ieu mangrupakeun skéma pikeun ngaronjatkeun sensitipitas sanggeus transkripsi sabalikna.Sateuacan ngawitan, urang kedah naroskeun ka hilir mana target anu dipikaresep ku urang, ku kituna ngarancang primer khusus pikeun target ieu pikeun pre-amplifikasi.
Ieu bisa dihontal ku nyieun primer dicampur kalawan nepi ka 100 pasang primers sarta siklus réaksi 10 nepi ka 14 kali.Ku alatan éta, Master Campuran husus dirancang pikeun sarat ieu diperlukeun pikeun pre-amplify cDNA diala.
Alesan pikeun netepkeun jumlah siklus antara 10 sareng 14 nyaéta jumlah siklus kawates ieu mastikeun acak antara rupa-rupa target, anu penting pikeun panalungtik anu peryogi inpormasi molekular kuantitatif.
Saatos pre-amplifikasi, urang tiasa nampi jumlah ageung cDNA, supados sensitipitas deteksi dina tonggong-tungtung ningkat pisan, sareng urang tiasa éncér sampel sareng ngalaksanakeun sababaraha réaksi PCR sacara real-time pikeun ngaleungitkeun kamungkinan kasalahan acak.
waktos pos: Apr-11-2023